免疫荧光(IF)是一种用于可视化观察细胞内过程、状态和结构的强大工具。 IF制剂可通过多种显微镜技术（如激光共聚焦、宽场荧光、全内反射成像、基态淬灭显微成像等）来加以分析，具体取决于应用目的或研究人员的关注重点。 与此同时，在很多使用至少一套简易荧光显微镜的研究工作组当中，IF早已成为不可缺少的一部分。
其次是荧光色素，与免疫复合物耦合，因此可以用显微镜观察目标结构。
标准IF流程
IF实验所需时间：约5个小时。
这是一种盖玻片上通过化学交联剂进行固定的培育细胞接受间接IF检查的标准方案。
· 湿盒非常适合IF实验，并且可以轻松完成自制（见幻灯片“如何制备湿盒”）。该处理可防止试剂干燥并允许在黑暗中进行培养，这对于处理荧光色素很重要，并且对于已经存在的荧光蛋白是必要的。
· 试剂用量的选择要确保盖玻片能够完全湿润。确保样本绝对不会完全干燥。
· 所有培育步骤都在室温下完成。
1. 清洗细胞两次并使用镊子小心地将带有向上翻转细胞的盖玻片放入湿盒。
2. 使用4% 福尔马林进行10分钟的固定并清洗3次。
3. 使用0.1% TX-100/PBS进行15-20分钟的透化处理并清洗3次。
4. 使用5%正常山羊血清/PBS或1% BSA/PBS进行45分钟的封闭（无需清洗）。
5. 在封闭溶液内稀释一抗并使用2小时（或在4℃下连夜使用）。清洗4次将未结合的一抗彻底清除掉。
6. 使用二抗进行1个小时的孵育，在封闭溶液或清洗缓冲液内进行稀释。
7. 吸取二抗，如有需要可使用Hoechst或DAPI [1 μg/ML]在PBS当中孵育10分钟。彻底清洗4次，即便此时还没有出现细胞核染色。
8. 用镊子轻轻取出盖玻片并将其进入H2O内，清除掉清洗缓冲液的残留盐分。
9. 在显微镜载玻片上滴一滴封固溶液并将盖玻片与细胞倒置这滴溶液上。用镊子轻轻按压试样，使封固介质均匀分布而不会挤压样本。
10.固化后就准备好进行显微镜观察了。
配方
清洗缓冲液
· 1 × PBS（磷酸盐生理盐水缓冲液）
1. 137 mM：NaCI
2. 2.7 mM：KCI
3. 10mM：Na2HPO4
4. 1.8 mM：KH2PO4
· 使用HCI将pH值调节到7.2-7.4
· 如为PBS++，需添加最终浓度为1 mM的CaCl2和MgCl2
· 如为PBS-T，需添加最终浓度为0.05%的Tween 20
固定缓冲液
· 福尔马林：
1. 将4% PFA（多聚甲醛）溶解于温暖（50-70℃）的dH2O当中，pH值8（使用NaOH进行调节）。
2. 将10 × PBS添加到最终浓度为1 × PBS的溶液当中（如100 mL 10 × PBS溶于900 mL 4% PFA/dH2O）。
3. 使用HCI将pH值调节到7.2-7.4。
· 甲醇（预先冷冻至-20℃）：
1. 100%甲醇（-20℃）
· 甲醇/丙酮（预先冷冻至 -20℃）：
1. 50%甲醇（-20℃）和50 %丙酮（-20℃）
透化缓冲液
· TX-100（Triton X-100)：
1. PBS，最终浓度0.1% TX-100
· 皂甙：
1. PBS，最终浓度0.1%的皂甙
· 其他清洁剂可在PBS当中以相同浓度进行使用。
封闭缓冲液
· BSA（牛血清蛋白）：
1. PBS，最终浓度为1% BSA
· 奶粉：
1. PBS，最终浓度为1%奶粉
· 正常血清：
1. PBS，最终浓度为5%正常血清
细胞核染料
· Hoechst或DAPI：
1. 在PBS中制备Hoechst 33342或DAPI溶液，最终工作浓度为1 μg/mL。
