‘宽场显微镜’是最基本的显微镜技术之一。其根本上是将整个感兴趣的样本暴露于光源下，由观察者或摄像头（也可连接到计算机显示器）获得图像的技术。
宽场与共聚焦显微镜的基本比较
在宽场显微镜中，显微镜载物台上的整个样本将暴露于光源。最基本的宽场显微镜检查形式是“明场显微镜检查”。
在共聚焦激光扫描显微镜中，用于激发荧光染料和蛋白质荧光的光源来自激光单元，该单元是整个共聚焦系统的组成部分。共聚焦显微镜检查的主要优势是可选择用户定义的感兴趣区域，而无需将整个样本暴露于荧光光源。另外，共聚焦显微镜可用于通过样本获得的光学切片，其优势在于可排除大部分失焦或背景荧光。
标准宽场显微镜没有共聚焦显微镜复杂，通常包括白色和荧光光源、显微镜和摄像头（有或没有连接的计算机）。在共聚焦系统中，显微镜本身只是配置的一部分，包括激光单元、共聚焦‘扫描头’（包含用于排除失焦光的针孔和用于从样本中收集光子的光电倍增管）和用于控制系统中多个参数以及图像处理的计算机。
比较宽场和共聚焦显微镜的光源
在传统的激光扫描共聚焦显微镜中，可能需要大约五种不同的激光源来覆盖常用荧光团的激发波长。例如，常用激光器为氩离子激光器，其可以产生一系列由滤光片选择的激发波长。氩离子激光器覆盖了激发光谱的绿色波长，并用于激发荧光团，如FITC（异硫氰酸荧光素）。激发光谱的黄色至红色波长被氦-氖激光覆盖，范围为约543至632nm。该光谱用于激发荧光团，如德克萨斯红和罗丹明。
在发光二极管（LED）作为宽场显微镜的荧光激发光源引入之前，激发光的主要来源为气弧光灯，这些灯至今仍广泛使用。宽场显微镜中常见的两种弧光灯为汞弧灯（也称为“汞燃烧器”或“汞蒸汽灯”）和氙弧灯。汞弧灯在大部分可见光谱中提供激发波长（见图2），然而，这种照明不均匀，主峰位于近紫外（UV）波长（313 nm、334 nm、365 nm、405 nm、436 nm）内，另外两个峰在546和579 nm处的光谱绿色/黄色部分。
与汞弧灯相比，氙弧灯在大部分可见光谱中提供激发波长，但该范围内的峰值不会达到汞燃烧器的强度。尽管与汞燃烧器相比，氙弧灯未扩展到光谱的紫外线部分，但其激发范围进一步进入红外波长。
虽然这些灯为荧光显微镜提供了极强的光源，但其也存在固有问题。这些灯泡的寿命有限，汞燃烧器通常持续200至300小时，氙弧灯持续400至600小时。由于其使用寿命有限，显微镜应仔细记录使用的小时数（尽管一些系统内置了使用小时数记录器）。如果气弧光灯在其推荐的寿命范围内用完，则存在管爆炸的危险。此外，如果经常接通/关闭灯，会显著缩短灯泡寿命，因此需要考虑这一点。需要仔细处置使用过的弧光灯，并应根据实验室各自的规定进行处置。
用于显微镜的新一代LED光源不仅提供全光谱的激发波长（约365至770 nm），且强度与弧光灯相当。与弧光灯相比，其主要优点是LED光源的寿命可长达50,000小时，无需预热或冷却时段。这也可以节省时间，因为LED单元仅需要在最初安装时进行一次对准调整。最后，废热是弧光灯的一个问题，因此将其安装在显微镜旁边的特殊外壳中。由于LED灯的大部分电气输入转换为光，其实际上不会产生废热。
比较宽场和共聚焦显微镜的图像捕获
如上所述，共聚焦扫描头包含一系列光电倍增管（PMT），用于从样本中收集光子。共聚焦扫描头通常包含至少三个PMT，负责收集红光、绿光和蓝光，但也会使用额外的PMT收集透射光或反射光。PMT不是摄像头，而是由真空管组成，真空管的一端有光子进入窗口，管体内有电子倍增元件。在最终组装并显示图像之前，将收集的光子量转换为电信号。许多共聚焦系统还配备了类似于宽场显微镜所用的摄像头。
基于光电二极管的传统摄像头有助于宽场显微镜中的图像捕获。数字显微镜摄像头包含半导体检测器，最常见的传感器是电荷耦合器件（CCD）、互补金属氧化物半导体（CMOS）和sCMOS（科学CMOS）。CCD和CMOS摄像头有许多相似之处，尽管它们以不同的方式处理图像信号，这会影响摄像头的捕捉时间以及信噪比等因素。由于其功能的固有性质，基于CCD的摄像头的帧速率可能比CMOS传感器慢10倍。因此，摄像头的选择取决于感兴趣样本的动态性质。
宽场显微镜的配置
宽场显微镜要么是正置式，从下方照射玻片，要么是倒置式，从上方照射玻片，如图5所示。该配置对待研究的样本有影响。正置显微镜通常用于安装在玻片上的固定样本。倒置显微镜用于观察活细胞。它们通常在液体溶液中生长。只有物镜位于样本下方且聚光器位于样本上方的配置才能保证物镜与样本足够接近。
透射照明技术包括相位对比度和微分干涉对比度（DIC）等对比度方法。然而，透射荧光显微镜检查是一种既不为人所知也未广泛使用的方法。该方法不使用双色透镜，而是激光法穿过聚光器和样本，并通过物镜收集发射光。然而，该技术存在许多初始问题，如背景水平高以及聚光器和物镜光学匹配困难[1]。最新进展克服了这些问题，使得透射荧光成像可用于体内成像和牙科研究等区域[2]。
宽场显微镜的对比度方法
显微镜检查的对比度方法包括微分干涉对比度（DIC）和相位对比度显微镜检查，可与宽场荧光显微镜检查结合使用。
将宽场荧光显微镜检查与对比度技术相结合，可提供有价值的生存力和形态学信息和图像。共聚焦系统能够同时捕捉可使用图像分析软件叠加的对比度和荧光图像。然而，在宽场荧光显微镜中，同时成像需要使用分视图摄像头适配器或使用两个单独的摄像头，一个用于对比度，一个用于荧光。
更常见的情况是，通过摄像头捕捉荧光图像，然后将光学器件更换为对比度照明，然后由相同的摄像头捕捉对比度图像。然后可使用图像分析软件对这些图像进行合并。
宽场显微镜的分辨率
显微镜的分辨率简单理解是区分样本细节的能力。这是样本的两个不同点仍可被视为独立实体的最小距离。有关决定分辨率的概念和因素的更多信息，请阅读此处。
与所有传统光学显微镜系统（包括共聚焦）一样，分辨率取决于数值孔径（NA）和光波长。在光学显微镜中，分辨率极限约为200 nm。在具有最高NA光学元件的完全对准显微镜系统中，分辨率极限大约是用于对样本成像的光波长的一半（或激发荧光团）。在将宽场与共聚焦显微镜进行比较时，两种方法中的理论分辨率极限相似。
然而，背景荧光会降低宽场显微镜获得的实际分辨率。如上所述，整个样本在宽场显微镜下照亮，因此焦平面上方和下方的区域也将发出荧光，通过摄像头捕捉并被观察者看到。因此，这种背景荧光会稍微掩盖来自荧光团的发射波长，导致信噪比总体降低，且随后可实现的分辨率和对比度降低。
在共聚焦系统中，（扫描头内的）针孔用于阻挡任何失焦光到达PMT检测器。尽管这具有通过阻挡背景和自动荧光产生清晰聚焦图像的优点，但一些失焦光子可能来自焦平面。这意味着一些信息可能会因针孔而丢失。共聚焦系统上产生的清晰图像与宽场显微镜无意中收集的失焦光之间存在平衡。但是，使用一种称为“反卷积”的采集后处理方法，可解决模糊和聚焦问题。该计算过程可将光子重新分配到其原点。
